Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа.
Микроскоп (от микро... и греческого skopeo — смотрю) - это оптический прибор для получения сильно увеличенного изображения изучаемого очень маленького объекта, невидимого невооружённым глазом. При помощи микроскопа можно рассмотреть мелкие детали строения объекта, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.
Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, которая характеризуется определённым разрешением. Разрешением оптической системы называется наименьшее расстояние между элементами наблюдаемого объекта, при котором эти элементы ещё могут быть отличены один от другого (под элементами объекта мы понимаем точки или линии).
Если объект удален на так называемое расстояние наилучшего видения, которое составляет250 мм, то для нормального человеческого глаза минимальное разрешение составляет примерно0,1 мм, а у многих людей — около0,2 мм. Примерно это соответствует толщине человеческого волоска. Размеры объектов, таких как растительные и животные клетки, мелкие кристаллы, детали микроструктуры металлов и сплавов и т.п., значительно меньше0,1 мм. Такие объекты принято называть микрообъекты. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопа определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм, т.е. разрешающая способность такого микроскопа составляет около 0,20 мкм или 200 нм.
Когда говорят о разрешающей способности микроскопа, подразумевают, также как и под разрешающей способностью человеческого глаза, раздельное изображение двух близко расположенных объектов. Однако, нужно понимать, что разрешающая способность и увеличение - это не одно и тоже. Например, если при помощи систем визуализации получить со светового микроскопа фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,20 мкм (т.е. менее разрешающей способности микроскопа), то, как бы мы не увеличивали изображение, линии все равно будут сливаться в одну. Т.е. мы сможем получить большое увеличение, но не улучшим его разрешение. Общее увеличение микроскопа равно произведению линейного увеличения объектива на угловое увеличение окуляра. Значения увеличений гравируются на оправах объективов и окуляров. Рассмотрим микроскоп плоского поля (не стереоскопический). Это биологические микроскопы, металлографические, поляризационные. Обычно объективы такого микроскопа имеют увеличения от 4 до 100 крат, а окуляры — от 5 до 16. Поэтому общее увеличение оптического микроскопа лежит в пределах от 20 до 1600 крат. Разумеется, технически возможно разработать и применить в микроскопе объективы и окуляры, которые дадут общее увеличение, значительно превышающее 1600 крат (например, существуют окуляры с увеличением 20 крат, которые в паре с объективом 100 крат дадут увеличение 2000 крат). Однако, обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются самоцелью оптической микроскопии. Назначение микроскопа состоит в том, чтобы обеспечить различение как можно более мелких элементов структуры препарата, т.е. в максимальном использовании разрешающей способности микроскопа. А она имеет предел, обусловленный волновыми свойствами света. Таким образом, различают полезное и неполезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение - это когда можно выявить новые детали строения объекта, а неполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения объекта.
Еще раз остановимся на понятии разрешающей способности. Разрешающая способность оптических приборов (так же ее называют разрешающая сила) характеризует способность этих приборов давать раздельные изображения двух близких друг к другу точек объекта. Наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображения сливаются, называется линейным или угловым пределом разрешения. Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличений, которые мы получаем с помощью микроскопа. Увеличения до 1250 крат называют полезными, т. к. при них мы различаем все элементы структуры объекта. При этом возможности микроскопа по разрешающей способности исчерпываются. Это увеличение получаем при использовании объектива 100 крат, работающего с масляной иммерсией, и окуляра 12,5 крат (полезное увеличение окуляров лежит от 7,5 до 12,5 крат). При увеличениях свыше 1250 крат не выявляются никакие новые детали структуры препарата. Однако иногда такие увеличения используют — в микрофотографии, при проектировании изображений на экран и в некоторых других случаях.
Когда необходимо существенно более высокое полезное увеличение, используют электронный микроскоп. Этот микроскоп обладает существенно более высокой разрешающей способностью, нежели оптический микроскоп. Электронный микроскоп - это прибор для наблюдения и фотографирования многократно (до 106 раз) увеличенного изображения объектов, в котором вместо световых лучей используются пучки электронов, ускоренных до больших энергий (30—100 кэв и более) в условиях глубокого вакуума.
Классификация световых микроскопов и области их применения
По строению оптической схемы различают прямые (объективы, насадка и окуляры расположены над объектом) и инвертированные (объект находится над оптической системой, формирующей изображение) микроскопы. Также различают микроскопы плоского поля (дающие двухмерное изображение) и стереоскопические микроскопы (объемное - трехмерное изображение).
По способам освещения разделяют микроскопы проходящего света (изображение формируется светом, проходящим через объект) и отраженного света (изображение формируется светом, отраженным от поверхности объекта).
Микроскопы можно разделить также по методам исследования:
Светлого поля (на светлом фоне выделяется более темный объект);
Темного поля (на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые структуры);
Фазового контраста (на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект);
Люминесценции (на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта);
Поляризованного света (наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта).
Можно выделить следующиеобласти применения световых микроскопов:
Биологические микроскопыдля лабораторных биологических и медицинских исследований прозрачных объектов. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный и люминесцентный свет.
Стереоскопические микроскопыв лабораториях и на различных производствах для получения увеличенных изображений объектов во время проведения рабочих операций. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля.
Металлографические микроскопыв научных и промышленных лабораториях для исследования непрозрачных объектов. Работа в отраженном свете. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный свет.
Поляризационные микроскопыв научных и исследовательских лабораториях для специализированных исследований в поляризованном свете. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля.
Объективы и окуляры для микроскопов
Объектив микроскопа - микрообъектив представляет собой сложную оптическую систему, образующую увеличенное изображение объекта, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Микрообъектив создает действительное перевернутое изображение, которое рассматривается через окуляр.
Объективы различаются по оптическим характеристикам и конструкции:
По степени исправления хроматической аберрации: ахроматы, апохроматы и др.
С исправленной кривизной изображения: - планахроматы, планапохроматы.
По длине тубуса микроскопа -160 ммдля проходящего света,190 ммдля отраженного света, бесконечность - для проходящего и отраженного света;
По свойствам иммерсии: сухие системы (без иммерсии) и иммерсионные системы.
Объективы апохроматы отличаются от ахроматов степенью исправления хроматической аберрации. Благодаря более совершенному устранению дефектов изображения, связанных с хроматической аберрацией, качество изображения, получаемого при наблюдении цветных объектов (окрашенные срезы, микроорганизмы и т.п.), особенно при больших увеличениях, значительно выше при использовании апохроматов. Апохроматы, а также ахроматы большого увеличения применяются совместно с компенсационными окулярами. На оправе апохроматов обычно выгравировано АПО (APO). У ахроматов и апохроматов, особенно большого увеличения, остается неисправленной кривизна поля изображения.
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения. По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением: V об =-Δ/F\" об * F\" об - фокусное расстояние микрообъектива * Δ - расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
G ок =¼ F ок
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра: G=V об *G ок
Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.
Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра ω , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества: 2y=500*tg(ω)/G * G - увеличение микроскопа
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
Диаметр выходного зрачка микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
где A – передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
Разрешающая способность микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа . Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное , то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа:
Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: * Увеличивая апертуру объектива, * Уменьшая длину волны света.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду , кедровое масло , раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит.
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит.
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
Согласно определению английского физика Рэлея разрешение оптической системы естьминимальное расстояние между двумя точками формируемого ею изображения,пока они еще видны раздельно . Рэлей показал, что максимальное разрешение линзы (т.е. минимальное расстояние d между двумя соседними точками изображения) прямо пропорционально длине используемой световой волны l и обратно пропорционально показателю преломления среды n , а также углу раскрытия a :
Длина волны l равна произведению скорости света v на период колебаний T . Показатель преломления n определяется как отношение скорости света в вакууме (300000 км/сек) к скорости света v в данной среде. Для воздуха показатель преломления равен 1.0, для воды - 1.3, для кедрового масла - 1.5. Угол раскрытия a характеризует способность линзы собирать световые лучи. Он определяется как угол между двумя линиями, соединяющими край линзы с точкой ее переднего фокуса и, следовательно, зависит от диаметра линзы и ее кривизны (рис. 3). Максимальное значение a для современных объективов достигает 138 о.
Рис. 3. Угол раскрытия объектива a
Из формулы Рэлея также следует, что разрешение микроскопа можно повысить тремя способами:
1) уменьшением длины волны l (этот способ реализован в ультрафиолетовом и электронном микроскопах);
2) повышением показателя преломления среды n (иммерсионные объективы);
3) увеличением диаметра линз объектива (т.е увеличением угла a ).
Для того чтобы было удобно сравнивать разрешение различных объективов, Аббе выделил знаменатель формулы Рэлея в отдельный показатель - численную апертуру NA
, после чего формула приняла следующий вид:
Численная апертура объектива NA = n * sin(a/2)
характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны. Введение усредняющего коэффициента 0.61 отражает тот факт, что максимальное разрешение обеспечивают только краевые лучи с максимальным углом a
, тогда как близкие к центральному лучи дают разрешение в два раза ниже (рис 3). NA воздушных объективов всегда меньше 1
(n
= 1, sin a
< 1), но иммерсионные объективы могут иметь NA и больше 1. Величина численной апертуры объектива гравируется на его корпусе, что позволяет легко вычислить его номинальное разрешение, используя формулу Рэлея-Аббе. В этих расчетах обычно принимают, что средняя длина волны дневного света составляет 550 нм. Численная апертура современных иммерсионных объективов достигает значений 1.3 – 1.4. Рекорд в этой области принадлежит объективу фирмы Карл Цейсс с апертурой 1.45, который способен формировать изображения микроструктур размером 170 нм.
Кроме разрешения в плоскости препарата d (разрешения по полю), объектив микроскопа обладает также разрешением по глубине dz (Young, 1998).
Особую роль разрешение по глубине (глубина фокуса) играет в конфокальной микроскопии, где на основе оптических срезов создаются трехмерные реконструкции микроструктур и где толщина оптического среза сильно влияет на качество реконструкции. Поэтому в конфокальных микроскопах предусмотрены специальные аппаратные и программные средства, позволяющие уменьшать глубину фокуса. Как следует из формулы Янга для обычного микроскопа глубина фокуса dz почти не отличается от разрешения по полю d.
Вторым по значимости показателем объективов и окуляров является увеличение, которое также всегда указано на их оправе. Как правило, чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). Однако эта зависимость соблюдается не всегда - существуют объективы одного увеличения с разной и даже регулируемой апертурой, а объективы с высокой апертурой могут иметь пониженное увеличение. В связи с этим различают полезное и бесполезное увеличение , имея ввиду, что полезное увеличение связано с разрешением, а бесполезное - нет. По существу бесполезное увеличение представляет собой масштабирование изображения, при котором объем полученной информации остается прежним или даже снижается. Тем не менее, оно может понадобиться, например, при согласовании размеров поля зрения микроскопа и ПЗС-матрицы цифрового фотоаппарата.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра. В некоторых микроскопах следует учитывать также увеличение дополнительных линз, встроенных в бинокулярную насадку. В микроскопах, оборудованных телекамерами или цифровыми фотоаппаратами, к оптическому увеличению добавляется еще и электронное масштабирование. Поскольку общее увеличение микроскопа в этом случае будет зависеть от многих факторов, в научных публикациях вместо него принято указывать марку микроскопа, а также увеличение и апертуру используемого объектива (например, Zeiss Axiolab, x100/1.25).
Калибровка микроскопа . Если предполагается измерять размеры клеток и других микроструктур, микроскоп необходимо прокалибровать. Калибровка микроскопа производится с помощью специального препарата - объект-микрометра. Он представляет собой предметное стекло, в центре которого нанесена шкала с делениями ценой 10 мкм (рис. 4). Встречаются также объект-микрометры в виде металлической пластины с отверстием в центре, где укреплено стекло со светлой шкалой на темном фоне. Однако, они менее удобны из-за сложности фокусировки на шкалу, особенно при недостатке света на больших увеличениях.
Для определения размеров микрообъектов используется специальный измерительный окуляр (окуляр-микрометр),
в котором также имеется шкала. Принцип калибровки заключается в определении цены деления шкалы окуляр-микрометра путем совмещения ее со шкалой
объект-микрометра. Зная цену деления объект-микрометра и число его делений, приходящихся на определенное число делений окуляр-микрометра, можно, разделив первое на второе, получить калибровочный фактор
. Умножение калибровочного фактора на результаты измерений
окуляр-микрометром позволит приводить их к абсолютной величине, выраженной в микрометрах. Для повышения точности измерений применяются также усовершенствованные окуляр-микрометры, которые снабжены микрометрическим винтом, передвигающим указатель в поле зрения.
Если микроскоп имеет встроенную телекамеру или цифровой фотоаппарат, его калибровку проводят следующим образом:
1. Устанавливают объект-микрометр в микроскоп таким образом, чтобы его деления занимали строго вертикальное положение.
2. Фокусируют объектив на шкалу объект-микрометра и получают ее цифровой снимок (рис. 4).
3. С помощью программы обработки изображений Scion Image (или аналогичной) получают строго горизонтальный профиль яркости вдоль шкалы.
4. Измеряют число пикселов (элементов растра) в отрезке, соединяющем два достаточно далеко отстоящих друг от друга деления шкалы.
5. Вычисляют калибровочный фактор, разделив длину отрезка (мкм) на измеренное в нем число пикселов.
Рис. 4. Шкала объект-микрометра (слева) и ее профиль яркости (справа).
Объектив х10, цена деления 10 мкм. На шкале дополнительно показана линия профиля яркости. Расстояние между крайними делениями вдоль этой линии составляет 400 мкм или 265 пикселов. Калибровочный фактор равен 1.509 (400/265).
Этот способ калибровки микроскопа проводится быстро и обладает высокой точностью (ошибка менее 1%). Естественно, калибровка должна проводиться для каждого объектива отдельно, даже если они имеют одинаковое номинальное увеличение.
Измерение разрешающей способности микроскопа. Формула Рэлея-Аббе позволяет рассчитать только номинальное (т.е. теоретически ожидаемое) разрешение объектива. Действительное разрешение объектива (и микроскопа в целом) может значительно отличаться от номинального.
Если микроскоп оборудован телекамерой или цифровым фотоаппаратом, измерение его реальной разрешающей способности не представляет большой проблемы. Для этого, однако, необходимо более подробно рассмотреть принцип его работы.
Описанная выше диффракция Френеля в виде концентрических круглых колец (рис. 1) возникает только в том случае, если световая волна обладает полной когерентностью. Обладающая частичной когерентностью система освещения микроскопа будет формировать диффракционую картину без выраженных колец. Более того, из-за неидеальности оптики обратное преобразование Фурье также даст изображение, сглаженное по сравнению с исходным. Следовательно, микроскоп вносит погрешность в процесс формирования изображения, что приводит к снижению его разрешающей способности. Для оценки этой погрешности в микроскопии применяют функцию рассеяния точки (P oint S pread F unction, PSF ) и функцию оптической передачи (O ptical T ransfer F unction, OTF ).
Рис. 5. Функция рассеяния точки (PSF ) и функция оптической передачи (OTF ). OTF является Фурье-образом PSF.
По существу, PSF представляет собой наблюдаемое в микроскоп изображение круглого отверстия минимального диаметра, которое освещено некогерентным светом, а OTF является его Фурье-образом (рис. 5). Чем меньше PSF (и больше сопряженная с ним OTF), тем выше разрешение. Таким образом, задача измерения разрешающей способности микроскопа сводится к определению его PSF (или OTF).
Существует много различных способов прямой и косвенной оценки величины PSF. Например, ее можно вычислить, если исследовать форму перепадов яркости в окрестностях границ микрообъектов. На практике, однако, наиболее простым и точным способом оценки максимального разрешения микроскопа является анализ его OTF, а не PSF.
Для того чтобы измерить разрешающую способность микроскопа при данном увеличении по OTF, необходимо:
1. Получить цифровую фотографию цитологического препарата.
2. Чтобы была возможность применить быстрый алгоритм преобразования Фурье, вырезать из нее квадратный участок, сторона которого L (в пикселах) равна степени числа 2 (128,256,512 и т. д.).
3. Выполнить прямое преобразование Фурье этого участка с помощью программы Scion Image (или аналогичной) и получить OTF микроскопа.
4. Измерить диаметр OTF (D) в пикселах (рис. 5).
5. Используя полученные параметры L и D , а также размеры ячейки матрицы камеры C в мкм, увеличение адаптера камеры Ma иувеличение объектива Mo ,рассчитать максимальное разрешение микроскопа d в нм по формуле:
Рис. 6. Изображение анафазы митоза (256х256) и его Фурье-образ.
Цифровая фотография делящейся митозом клетки корешка лука (рис. 6, слева) снята при помощи микроскопа Zeiss Axiolab, объектив x100/1.25, камера Axiocam MR с адаптером x0.63, размер ячейки ПЗС-матрицы 6.7 мкм (указан в спецификации). Фурье-образ этого снимка (рис. 6, справа) получен в программе Scion Image после кадрирования рамкой 256х256. Измеренный с помощью программы Scion Image диаметр OTF составляет 129 пикселов, рассчитанное по приведенной формуле разрешение микроскопа - 211 нм.
Точность данного метода измерения разрешающей способности микроскопа зависит, главным образом, от корректности определения диаметра OTF. Однако, как видно из профиля яркости OTF (рис. 7), ее граница плавно снижается к уровню случайного шума, что затрудняет измерение D .
Один из способов повышения объективности определения диаметра OTF заключается в том, чтобы измерять его (или радиус OTF, который обозначается как HWHM ) на половине максимальной яркости сигнала. Оценка разрешения микроскопа при этом будет несколько ниже максимального значения.
Другой способ состоит в использовании специальных препаратов, приготовленных из диатомовых водорослей и содержащих мелкие регулярные структуры на пределе разрешения микроскопа. В этом случае в Фурье-образе появляются контрастные рефлексы, которые значительно облегчают точное измерение диаметра OTF.
Рис. 7. Профиль яркости OTF от центра к периферии. HWHM - радиус OTF на уровне половины ее максимума (H alf W idth on H alf M aximum).
PSF и OTF непосредственно связаны с формулой Рэлея-Аббе. В свободном от аберраций микроскопе PSF обладает круговой симметрией и определяется выражением
где h(r) – это PSF, J 1 - функция Бесселя первого рода, a = 2pNA/l.
Таким образом, по крайней мере, в идеальном случае форма PSF определяется только двумя параметрами - длиной волны l и численной апертурой объектива NA. Аналитическое описание PSF может использоваться для повышения разрешающей способности микроскопа путем дополнительной обработки изображений на компьютере.
Предмет h помещают несколько дальше переднего фокуса объектива. Объектив дает действительное, обратное, увеличенное изображение H ’ , находящееся между передним фокусом окуляра и оптическим центром окуляра. Это промежуточное изображение рассматривается в окуляр как в лупу. Окуляр дает мнимое, прямое, увеличенное изображение H , которое расположено на расстоянии наилучшего зрения S ≈ 25 см от оптического центра глаза.
Это изображение мы рассматриваем глазом, на его сетчатке формируется действительное, обратное, уменьшенное изображение.
Увеличение
микроскопа
– отношение размеров мнимого изображения
к размерам рассматриваемого через
микроскоп предмета:
.
Умножим числитель и знаменатель на
размер промежуточного изображения H
’
:
.
Таким образом, увеличение микроскопа
равно произведению увеличения объектива
на увеличение окуляра. Увеличение
объектива
можно выразить через характеристики
микроскопа, используя подобие прямоугольных
треугольников
,
где L
оптическая
длина
тубуса
:
расстояние между задним фокусом объектива
и передним фокусом окуляра (считаем,
что L
>> F
об).
Увеличение
окуляра
.
Следовательно, увеличение микроскопа
равно:
.
4. Разрешающая способность и предел разрешения микроскопа. Дифракционные явления в микроскопе, понятие о теории Аббе.
Предел разрешения микроскопа z – это наименьшее расстояние между двумя точками рассматриваемого в микроскоп объекта, когда эти точки еще воспринимаются отдельно. Предел разрешения обычного биологического микроскопа лежит в диапазоне 34 мкм. Разрешающей способностью микроскопа называют способность давать раздельное изображение двух близко расположенных точек исследуемого объекта, то есть это величина, обратная пределу разрешения.
Дифракция света налагает предел на возможность различения деталей объектов при их наблюдении в микроскоп. Так как свет распространяется не прямолинейно, а огибает препятствия (в данном случае, рассматриваемые объекты), то изображения мелких деталей объектов получаются размытыми.
Э. Аббе
предложил дифракционную
теорию разрешающей способности
микроскопа
.
Пусть предметом, который мы хотим
рассмотреть в микроскоп, будет
дифракционная решетка с периодом d
.
Тогда минимальная деталь предмета,
которую мы должны различить, как раз и
будет периодом решетки. На решетке
происходит дифракция света, но диаметр
объектива микроскопа ограничен, и при
больших углах дифракции не весь свет,
прошедший через решетку, попадает в
объектив. Реально свет от предмета
распространяется к объективу в некотором
конусе. Получаемое изображение тем
ближе к оригиналу, чем больше максимумов
участвует в формировании изображения.
Свет от предмета распространяется к
объективу от конденсора в виде конуса,
который характеризуется угловой
апертурой
u
– угол, под которым виден объектив из
центра рассматриваемого предмета, то
есть угол между крайними лучами
конического светового пучка, входящего
в оптическую систему. Согласно Э. Аббе,
для получения изображения решетки, даже
самого нечеткого, в объектив должны
попасть лучи любых двух порядков
дифракционной картины, например, лучи,
образующие центральный и, по крайней
мере, первый дифракционный максимум.
Вспомним, что для наклонного падения
лучей на дифракционную решетку ее
главная формула имеет вид:
.
Если свет падает под углом
,
а угол дифракции для первого
максимума
равен
,
то формула приобретает вид
.
За предел разрешения микроскопа следует
принять постоянную дифракционной
решетки, тогда
,
где
- длина волны света.
Как видно из формулы, один из способов уменьшения предела разрешения микроскопа – использование света с меньшей длиной волны. В связи с этим применяют ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в ультрафиолетовых лучах. Принципиальная оптическая схема такого микроскопа аналогична схемам обычного микроскопа. Основное отличие заключается в использовании оптических устройств, прозрачных для УФ-света, и в особенностях регистрации изображения. Так как глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение (кроме того, оно обжигает глаза, т.е. является опасным для органа зрения), то употребляются фотопластинки, люминесцентные экраны или электронно-оптические преобразователи.
Если в
пространство между объективом и покровным
стеклом препарата поместить специальную
жидкую среду, называемую иммерсией
,
то предел разрешения также уменьшается:
,
где n
– абсолютный показатель преломления
иммерсии, A
– числовая
апертура объектива
.
В качестве иммерсии используют воду (n
=
1,33),
кедровое масло (n
= 1,515), монобромнафталин (n
=
1,66)
и др. Для каждого вида иммерсии
изготавливают специальный объектив, и
его можно применять только с данным
видом иммерсии.
Еще один способ уменьшения предела разрешения микроскопа – это увеличение апертурного угла. Этот угол зависит от размеров объектива и расстояния от предмета до объектива. Однако расстояние от предмета до линзы нельзя изменять произвольно, оно постоянно для каждого объектива и приближать предмет нельзя. В современных микроскопах апертурный угол достигает 140 о (соответственно, u /2 = 70 о). С таким углом получают максимальные числовые апертуры и минимальные пределы разрешения.
Данные приведены для наклонного падения света на объект и длины волны 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз человека.
Обратите внимание на то, что окуляр совершенно не влияет на разрешающую способность микроскопа, он только создает увеличенное изображение объектива.
Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа , т.е. минимальным расстоянием, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. разрешающая способность зависит от числовой апертуры объектива, конденсора и длины волны света, которым освещается препарат. Числовая апертура (раскрытие) зависит от угловой апертуры и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и конденсора и препаратом.
Угловая апертура объектива - это максимальный угол (AOB), под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат. Числовая апертура объектива равна произведению синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды, находящейся между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива. N.A. = n sinα где, N.A. - числовая апертура; n - показатель преломления среды между препаратом и объективом; sinα - синус угла α равного половине угла АОВ на схеме.
Таким образом, апертура сухих систем (между фронтальной линзой объектива и препаратом-воздух) не может быть более 1 (обычно не более 0,95). Среда, помещаемая между препаратом и объективом, называется иммерсионной жидкостью или иммерсией, а объектив, рассчитанный для работы с иммерсионной жидкостью, называют иммерсионным. Благодаря иммерсии с более высоким показателем преломления чем у воздуха, можно повысить числовую апертуру объектива и, следовательно, разрешающую способность.
Числовая апертура объективов всегда гравируется на их оправах.
Разрешающая способность микроскопа зависит также от апертуры конденсора. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет вид R=λ/2NA, где R - предел разрешения; λ - длина волны; N.A - числовая апертура. Из этой формулы видно, что при наблюдении в видимом свете (зеленый участок спектра - λ=550нм), разрешающая способность (предел разрешения) не может быть > 0,2мкм
Влияние числовой апертуры объектива микроскопа на качество изображения
Пути повышения оптической разрешающей способности
Выбор большого угла светового конуса, как со стороны объектива, так и со стороны источника освещения. Благодаря этому, возможно, собрать в объективе более преломленные лучи света от очень тонких структур. Таким образом, первый путь повышения разрешения - это использование конденсора, числовая апертура которого соответствует числовой апертуре объектива.
Второй способ - использование иммерсионной жидкости между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом. Так мы воздействуем на показатель преломления среды n, описанный в первой формуле. Его оптимальное значение, рекомендуемое для иммерсионных жидкостей, составляет 1.51.
Иммерсионные жидкости
Иммерсионные жидкости необходимы для увеличения числовой апертуры и соответственно повышения разрешающей способности иммерсионных объективов, специально рассчитанных для работы с этими жидкостями и, соответствующим образом, маркированными. Иммерсионные жидкости, помещенные между объективом и препаратом, имеют более высокий показатель преломления, чем воздух. Поэтому, отклоненные мельчайшими деталями объекта лучи света, не рассеиваются, выходя из препарата, и попадают в объектив, что приводит к повышению разрешающей способности.
Существуют объективы водной иммерсии (маркированные белым кольцом), масляной иммерсии (черное кольцо), глицериновой иммерсии (желтое кольцо), монобромнафталиновой иммерсии (красное кольцо). В световой микроскопии биологических препаратов применяются объективы водной и масляной иммерсии. Специальные кварцевые объективы глицериновой иммерсии пропускают коротковолновое ультрафиолетовое излучение и предназначены для ультрафиолетовой (не путать с люминесцентной) микроскопии (то есть для изучения биологических объектов, избирательнопоглощающих ультрафиолетовые лучи). Объективы монобромнафталиновой иммерсии в микроскопии биологических объектов не используются.
В качестве иммерсионной жидкости для объектива водной иммерсии используется дистиллированная вода, масляной иммерсии - природное (кедровое) или синтетическое масло с определенным показателем преломления.
В отличие от других иммерсионных жидкостей масляная иммерсия является гомогенной, так как имеет показатель преломления равный или очень близкий показателю преломления стекла. Обычно этот показатель преломления (n) рассчитан для определенной спектральной линии и определенной температуры и указывается на флаконе с маслом. Так, например, показатель преломления иммерсионного масла для работы с покровным стеклом для спектральной линии D в спектре натрия при температуре =20°С равен 1,515 (nD 20 = 1,515), для работы без покровного стекла (nD 20 = 1,520).
Для работы с объективами-апохроматами нормируется также дисперсия, то есть разность показателей преломления для различных линий спектра.
Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.
Учитывая вышесказанное, ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом. При некоторых способах микроскопии для увеличения апертуры конденсора, иммерсионная жидкость (чаще дистиллированная вода) помещается между конденсором и препаратом.
